Москва °C

Последние новости

23:33
Повышенный холестерин и преждевременная смерть: как они взаимосвязаны?
19:03
Недостаток сна отражается на работе сердечной мышцы
23:30
«Виагра» оказалась безопасным препаратом
23:25
На праздник Ысыах Олонхо в Якутии пришло 4000 человек
23:31
Как спиртное способствует прогрессированию раковых опухолей?
19:19
Электронные сигареты безопаснее табака или нет?
23:35
Какую пользу несут цельнозерновые продукты?
22:00
Мужчины способны ухаживать за своим партнером
эксклюзив
19:30
Мишка из роз - создан чтобы дарить радость!
19:30
Можно ли купить слуховой аппарат без врача?
03:14
Качественные строительные материалы - залог надежного дома
01:56
Медкнижка качественно и быстро: дружите с законом и временем
23:30
Плохая память, как показатель деменции
23:30
В России вводят реестр пациентов с декомпенсированной бронхиальной астмой
эксклюзив
22:43
Лечение психических заболеваний в Израиле
15:50
Вас ждут популярные игровые видеослоты в онлайн казино Слотс-Док-Ком
03:50
Игровые автоматы онлайн - выигрыш по вкусу
23:23
Какая мука самая полезная?
19:27
Как узнать правдивую информацию о докторе?
16:18
Когда может потребоваться помощь дерматолога
23:28
Женщинам нежелательно лечиться у врачей мужского пола
эксклюзив
21:17
Подтяжка лица мезонитями
16:35
Страхование жизни и здоровья «УРАЛСИБ Страхование»
01:30
Голливудские звёзды презентуют новые парфюмы
23:26
Кетогенная диета может привести к сахарному диабету
13:15
Клиника эстетической медицины GMTClinic – услуги контурной пластики
00:37
Аппараты для ультразвуковой диагностики
23:27
Ревматоидный артрит поддается лечению?
23:33
В России повышается внутрибольничная смертность
23:17
Игольчатый радиочастотный лифтинг в Израиле

Контаминации в исследованиях методом ПЦР

Публикации
120
0

Одна из важнейших особенностей метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) это его высокая чувствительность. В тоже время, это является и его основной слабостью, которая ведет к получению ложноположительных результатов из-за экзогенных загрязнений. Таким образом, предотвращение загрязнения (контаминации) является самым важным аспектом при создании лаборатории ПЦР, особенно для диагностических целей. Во многих ситуациях, меры предосторожности, которые обычно применяются при обращении с микробиологическими материалами, в равной степени применимы к процедурам, связанным с ПЦР.

Источники загрязнения

Существует четыре основных источника загрязнения ПЦР. Самым важным является продукт ПЦР из предыдущих амплификаций, так называемое загрязнение переноса. Из-за огромной мощности амплификации ПЦР и ее способности генерировать до 1012 молекул продукта в одной реакции, это самый серьезный источник загрязнений. Когда такое большое количество продукта генерируется неоднократно в течение определенного периода времени, вероятность контаминации становится все более высокой. Это дополнительно усугубляется тем фактом, что многие диагностические приложения требуют от ПЦР чувствительности на уровне одной молекулы. В этих условиях даже одной из миллиардов молекул, генерируемых из одной реакции, достаточно для создания ложноположительного результата. Второй источник загрязнения - это клонированная ДНК, ранее обработанная в лаборатории. Третий тип - это загрязнение образца. Этот источник загрязнения наиболее вреден для образцов, которые требуют интенсивной обработки до амплификации. Четвертым источником является повсеместно присутствующая матричная ДНК в окружающей среде.

Принципы предотвращения контаминации

Основными принципами предотвращения заражения в ПЦР являются:

  1. Строгое физическое разделение лаборатории на участки. Рекомендуется использовать три различные рабочие области, используемые для: стадии подготовки образца, стадии постановки ПЦР и стадии обработки данных. Используемые на каждом этапе приборы и лабораторное оборудование также должны быть разделены по областям. Этот принцип относится не только к приборам, но и к компьютерам и другим принадлежностям.
  2. Правильная организация рабочего процесса позволит минимизировать риск контаминации. Для этого все используемые реагенты должны быть автоклавированы, если это допускается. Обязательно использование и частая смена перчаток. Желательно также использовать лицевые маски. Идеальным является использование дозаторов с положительным вытеснением, если таких нет, используются наконечники с фильтром, защищающим конус дозатора от аэрозольных загрязнений. Старайтесь сводить к минимуму число циклов ПЦР, поскольку высокочувствительные анализы более подвержены загрязнению. Предпочтительно использование одноразовых предметов, таких как пластиковые пробирки, наконечники дозаторов и другие емкости. Если вам позволяет финансовое положение, следует разделить персонал для части проведения ПЦР и обработки данных. Если этого сделать нельзя, постарайтесь организовать рабочий процесс так, чтобы процедуры проведения ПЦР и обработки данных выполнялись в разные дни. Использование закрытых ПЦР-систем, например системы TaqMan®, позволяет проводить анализ на основе флуореснценции продуктов реакции. Это позволяет исключить перекрестное загрязнение, возникающее при открытии сосудов.

Обнаружение загрязнений

Мониторинг загрязнения, вероятно, так же важен, как и меры по его предотвращению. В обычной практике загрязнения возникают если не у все, то у большинства исследователей. Для облегчения мониторинга загрязнения необходимо предпринять следующие меры:

Отрицательный контроль должен быть включен в каждый эксперимент. Должны быть включены различные отрицательные контрольные образцы, проверяющие этапы процесса ПЦР, при которых может произойти загрязнение. ПЦР-реагенты будут проверяться только на загрязнение в процессе исследования, но не на стадии подготовки образца.

В некоторых видах исследований продукты ПЦР из разных образцов будут иметь разные последовательности, например, вариации последовательности в бактериях, происходящие в разное время. В этих ситуациях секвенирование продуктов ПЦР или методов, которые отражают вариабельность последовательности, например, гетеродуплексный анализ и анализ полиморфизма односвязных полиморфизмов (SSCP), полезны при проверке подлинности положительного результата.

Заключение

Контаминация является единственным наиболее важным препятствием для использования ПЦР в диагностических целях. Загрязнения можно избежать только путем тщательного соблюдения правил организации процесса. В сочетании с системами мониторинга, предназначенными для обнаружения загрязнений, высокая чувствительность ПЦР перестает быть серьезной проблемой и становится ее преимуществом.

0 комментариев