Москва °C

Последние новости

22:35
Бросать пить и курить нужно параллельно
16:56
Частые походы в туалет ночью, как признак гипертонической болезни
11:19
Физические упражнения эффективнее диеты
17:55
Игровые автоматы – игры на реальные деньги в Вулкан
20:29
Кому подойдет несъемное протезирование зубов
13:54
Автоматы онлайн – игровые слоты в новом Вулкан для активной игры
23:03
К чему может привести злоупотребление алкоголем
22:50
Диагностика и лечение пневмонии
22:30
Виды ангины и методы лечения
20:30
Кресла-коляски в 2019 году
20:09
Сохранение нижних конечностей от ампутации
17:32
Рекомендации по выполнению упражнений Кегеля
12:56
9 советов правильного питания для беременных
16:57
Как снизить риск инвалидности за 1 час в неделю
15:16
Автомат онлайн Golden Glen – азарт от игры на слотах
12:42
МРЭО круглосуточно
12:39
Ортопедический корсет для спины: показания для использования изделия
20:59
Как быть сильным мужчиной и оставаться таковым?
16:45
Медицинская справка с доставкой для применения
12:45
Спорт без отрыва от учебы: как студенту организовать свои тренировки
12:44
Недержание: как вернуть в свою жизнь комфорт и спокойствие
11:20
Новый образ и стиль с помощью накладных волос и тресс
23:55
Автоматы онлайн – игры на деньги и бесплатно для игроков в клубе Вулкан
12:30
Почему стоит покупать детскую одежду в интернет-магазине
11:22
Где можно заказать суши и роллы с доставкой на дом в Воткинске
14:22
Лечение наркологической зависимости
13:00
Вспышка кишечной инфекции: как остановить распространение
13:43
Насилие на экране не отражается на детской психике
эксклюзив
00:50
Двухчасовой интервал между ужином и сном – необходимость или нет?
00:47
Может ли алкоголь вызывать мигрень?

Контаминации в исследованиях методом ПЦР

Публикации
305
0

Одна из важнейших особенностей метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) это его высокая чувствительность. В тоже время, это является и его основной слабостью, которая ведет к получению ложноположительных результатов из-за экзогенных загрязнений. Таким образом, предотвращение загрязнения (контаминации) является самым важным аспектом при создании лаборатории ПЦР, особенно для диагностических целей. Во многих ситуациях, меры предосторожности, которые обычно применяются при обращении с микробиологическими материалами, в равной степени применимы к процедурам, связанным с ПЦР.

Источники загрязнения

Существует четыре основных источника загрязнения ПЦР. Самым важным является продукт ПЦР из предыдущих амплификаций, так называемое загрязнение переноса. Из-за огромной мощности амплификации ПЦР и ее способности генерировать до 1012 молекул продукта в одной реакции, это самый серьезный источник загрязнений. Когда такое большое количество продукта генерируется неоднократно в течение определенного периода времени, вероятность контаминации становится все более высокой. Это дополнительно усугубляется тем фактом, что многие диагностические приложения требуют от ПЦР чувствительности на уровне одной молекулы. В этих условиях даже одной из миллиардов молекул, генерируемых из одной реакции, достаточно для создания ложноположительного результата. Второй источник загрязнения - это клонированная ДНК, ранее обработанная в лаборатории. Третий тип - это загрязнение образца. Этот источник загрязнения наиболее вреден для образцов, которые требуют интенсивной обработки до амплификации. Четвертым источником является повсеместно присутствующая матричная ДНК в окружающей среде.

Принципы предотвращения контаминации

Основными принципами предотвращения заражения в ПЦР являются:

  1. Строгое физическое разделение лаборатории на участки. Рекомендуется использовать три различные рабочие области, используемые для: стадии подготовки образца, стадии постановки ПЦР и стадии обработки данных. Используемые на каждом этапе приборы и лабораторное оборудование также должны быть разделены по областям. Этот принцип относится не только к приборам, но и к компьютерам и другим принадлежностям.
  2. Правильная организация рабочего процесса позволит минимизировать риск контаминации. Для этого все используемые реагенты должны быть автоклавированы, если это допускается. Обязательно использование и частая смена перчаток. Желательно также использовать лицевые маски. Идеальным является использование дозаторов с положительным вытеснением, если таких нет, используются наконечники с фильтром, защищающим конус дозатора от аэрозольных загрязнений. Старайтесь сводить к минимуму число циклов ПЦР, поскольку высокочувствительные анализы более подвержены загрязнению. Предпочтительно использование одноразовых предметов, таких как пластиковые пробирки, наконечники дозаторов и другие емкости. Если вам позволяет финансовое положение, следует разделить персонал для части проведения ПЦР и обработки данных. Если этого сделать нельзя, постарайтесь организовать рабочий процесс так, чтобы процедуры проведения ПЦР и обработки данных выполнялись в разные дни. Использование закрытых ПЦР-систем, например системы TaqMan®, позволяет проводить анализ на основе флуореснценции продуктов реакции. Это позволяет исключить перекрестное загрязнение, возникающее при открытии сосудов.

Обнаружение загрязнений

Мониторинг загрязнения, вероятно, так же важен, как и меры по его предотвращению. В обычной практике загрязнения возникают если не у все, то у большинства исследователей. Для облегчения мониторинга загрязнения необходимо предпринять следующие меры:

Отрицательный контроль должен быть включен в каждый эксперимент. Должны быть включены различные отрицательные контрольные образцы, проверяющие этапы процесса ПЦР, при которых может произойти загрязнение. ПЦР-реагенты будут проверяться только на загрязнение в процессе исследования, но не на стадии подготовки образца.

В некоторых видах исследований продукты ПЦР из разных образцов будут иметь разные последовательности, например, вариации последовательности в бактериях, происходящие в разное время. В этих ситуациях секвенирование продуктов ПЦР или методов, которые отражают вариабельность последовательности, например, гетеродуплексный анализ и анализ полиморфизма односвязных полиморфизмов (SSCP), полезны при проверке подлинности положительного результата.

Заключение

Контаминация является единственным наиболее важным препятствием для использования ПЦР в диагностических целях. Загрязнения можно избежать только путем тщательного соблюдения правил организации процесса. В сочетании с системами мониторинга, предназначенными для обнаружения загрязнений, высокая чувствительность ПЦР перестает быть серьезной проблемой и становится ее преимуществом.

0 комментариев