Москва °C

Последние новости

20:54
Почему стоит отказаться от каплей в нос при простуде?
эксклюзив
20:54
Взаимосвязь рака кишечника и избыточного веса
20:54
Новые секреты долголетия, обнаруженные учеными
21:42
Джойказино – платные игровые автоматы онлайн
01:00
Вулкан 24 – круглосуточные новые игровые автоматы онлайн
21:54
Бесплатные Игровые автоматы в Вулкан Старс онлайн
21:46
Алгоритм игры на новых игровых автоматах в Вулкан 24
00:30
Секреты онлайн-казино, о которых должны знать новички
21:50
Вулкан Платинум предлагает большой выбор игровых автоматов в режиме онлайн
19:00
Чем отличается Антиплагиат.ВУЗ от других сервисов проверки уникальности?
11:23
Вулкан Делюкс предлагает только яркие игровые автоматы
20:27
Как прочность костей зависит от питания?
19:01
Вулкан 24 – великолепные слоты онлайн и баснословные выигрыши
12:00
Игровые автоматы онлайн: деньги, настроение и азарт
12:36
Препараты от изжоги имеют опасные побочные эффекты
18:29
Какие окна лучше для деревянного дома, деревянные или пластиковые
18:05
Силиконовая грудь: красиво или опасно?
19:29
Возможности игровых автоматов онлайн в Вулкан Платинум
18:11
Больше движения – меньше депрессии
00:30
Игровые автоматы онлайн в Вулкан Платинум – как заработать и получить эмоции?
21:25
БАВ и фитодобавки настоящая угроза здоровью и жизни
19:45
Игровые автоматы онлайн в Вулкан 24 – преимущества пополнения баланса
19:52
Как сообщить близким, что вы выиграли на игровых автоматах онлайн в Вулкан?
19:23
Казино Вулкан – новые игровые автоматы с изюминкой
15:22
Вулкан 24 – игровые автоматы онлайн в любое время суток
15:06
Настоящая прибыль в казино Вулкан Гранд
12:22
Попасть к лучшим врачам в Санкт-Петербурге
15:01
Вулкан Гранд – прибыльные фантастические игровые автоматы онлайн
18:19
Игровые автоматы Вулкан Вегас – шикарные слоты для результатов
18:13
Выиграй джек-пот в Вулкан Платинум и получи эмоции

Контаминации в исследованиях методом ПЦР

Публикации
164
0

Одна из важнейших особенностей метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) это его высокая чувствительность. В тоже время, это является и его основной слабостью, которая ведет к получению ложноположительных результатов из-за экзогенных загрязнений. Таким образом, предотвращение загрязнения (контаминации) является самым важным аспектом при создании лаборатории ПЦР, особенно для диагностических целей. Во многих ситуациях, меры предосторожности, которые обычно применяются при обращении с микробиологическими материалами, в равной степени применимы к процедурам, связанным с ПЦР.

Источники загрязнения

Существует четыре основных источника загрязнения ПЦР. Самым важным является продукт ПЦР из предыдущих амплификаций, так называемое загрязнение переноса. Из-за огромной мощности амплификации ПЦР и ее способности генерировать до 1012 молекул продукта в одной реакции, это самый серьезный источник загрязнений. Когда такое большое количество продукта генерируется неоднократно в течение определенного периода времени, вероятность контаминации становится все более высокой. Это дополнительно усугубляется тем фактом, что многие диагностические приложения требуют от ПЦР чувствительности на уровне одной молекулы. В этих условиях даже одной из миллиардов молекул, генерируемых из одной реакции, достаточно для создания ложноположительного результата. Второй источник загрязнения - это клонированная ДНК, ранее обработанная в лаборатории. Третий тип - это загрязнение образца. Этот источник загрязнения наиболее вреден для образцов, которые требуют интенсивной обработки до амплификации. Четвертым источником является повсеместно присутствующая матричная ДНК в окружающей среде.

Принципы предотвращения контаминации

Основными принципами предотвращения заражения в ПЦР являются:

  1. Строгое физическое разделение лаборатории на участки. Рекомендуется использовать три различные рабочие области, используемые для: стадии подготовки образца, стадии постановки ПЦР и стадии обработки данных. Используемые на каждом этапе приборы и лабораторное оборудование также должны быть разделены по областям. Этот принцип относится не только к приборам, но и к компьютерам и другим принадлежностям.
  2. Правильная организация рабочего процесса позволит минимизировать риск контаминации. Для этого все используемые реагенты должны быть автоклавированы, если это допускается. Обязательно использование и частая смена перчаток. Желательно также использовать лицевые маски. Идеальным является использование дозаторов с положительным вытеснением, если таких нет, используются наконечники с фильтром, защищающим конус дозатора от аэрозольных загрязнений. Старайтесь сводить к минимуму число циклов ПЦР, поскольку высокочувствительные анализы более подвержены загрязнению. Предпочтительно использование одноразовых предметов, таких как пластиковые пробирки, наконечники дозаторов и другие емкости. Если вам позволяет финансовое положение, следует разделить персонал для части проведения ПЦР и обработки данных. Если этого сделать нельзя, постарайтесь организовать рабочий процесс так, чтобы процедуры проведения ПЦР и обработки данных выполнялись в разные дни. Использование закрытых ПЦР-систем, например системы TaqMan®, позволяет проводить анализ на основе флуореснценции продуктов реакции. Это позволяет исключить перекрестное загрязнение, возникающее при открытии сосудов.

Обнаружение загрязнений

Мониторинг загрязнения, вероятно, так же важен, как и меры по его предотвращению. В обычной практике загрязнения возникают если не у все, то у большинства исследователей. Для облегчения мониторинга загрязнения необходимо предпринять следующие меры:

Отрицательный контроль должен быть включен в каждый эксперимент. Должны быть включены различные отрицательные контрольные образцы, проверяющие этапы процесса ПЦР, при которых может произойти загрязнение. ПЦР-реагенты будут проверяться только на загрязнение в процессе исследования, но не на стадии подготовки образца.

В некоторых видах исследований продукты ПЦР из разных образцов будут иметь разные последовательности, например, вариации последовательности в бактериях, происходящие в разное время. В этих ситуациях секвенирование продуктов ПЦР или методов, которые отражают вариабельность последовательности, например, гетеродуплексный анализ и анализ полиморфизма односвязных полиморфизмов (SSCP), полезны при проверке подлинности положительного результата.

Заключение

Контаминация является единственным наиболее важным препятствием для использования ПЦР в диагностических целях. Загрязнения можно избежать только путем тщательного соблюдения правил организации процесса. В сочетании с системами мониторинга, предназначенными для обнаружения загрязнений, высокая чувствительность ПЦР перестает быть серьезной проблемой и становится ее преимуществом.

0 комментариев